Иммуноферментный анализ интересен, прежде всего, клеточными реакциями и механизмами иммунной защиты, на которых он основан. Метод объединяет два процесса: иммунная реакция связывает искомые молекулы и элементы клетки, а ферментная реакция даёт возможность оценить их концентрацию, применяются для этого специальные иммуноферментные анализаторы.
Иммунная реакция ведёт к образованию иммунного комплекса — устойчивой связки антигена (информационной молекулы, присутствующей в каждой клетке) с антителом (белковой молекулой иммунной клетки). Это происходит в том случае, если объект «чужой», то есть представляет опасность для организма. Если подозрительная клетка оказалась «своей», то антитело не вступает во взаимодействие с её антигеном.
Существует пять основных видов антител, или иммуноглобулинов — A, M, G, D, E, каждый из которых «отвечает» за защиту разных частей организма (кожи, слизистых, крови). Для лабораторного теста выбирают один тип иммуноглобулина, наиболее чувствительного к искомому микробу. Именно благодаря специфичности и безошибочности клеточного поведения (99,99% точность идентификации опасных клеток) метод иммуноферментного анализа обладает уникальной точностью.
Вторая составляющая метода — ферментативная реакция, при которой одно вещество (субстрат) под влиянием фермента превращается в другое. Здесь также используются специфические связи, характерные для единственной возможной реакции. Таким образом, у исследователей появляется возможность идентифицировать конкретный искомый объект по ожидаемому изменению окраски вещества под воздействием одного из ферментов (чаще всего задействуют пероксидазу, щелочную фосфатазу, авидин). Далее применяют довольно распространённый в лабораторной практике метод колориметрии, позволяющий определить концентрацию вещества по цветовой насыщенности раствора.
Процедура иммуноферментного анализа может проводиться одним из двух способов:
В прямом анализе для выявления искомого антигена (микроба, гормона) используют соответствующие ему антитела, соединённые с меткой, которая служит субстратом ферментативной реакции. Процесс состоит из нескольких этапов:
-
Биологический материал (мазки, кровь, соскобы) помещают в лунки лабораторного планшета на 15–30 мин — за это время антигены клеток прикрепляются к поверхности лунок.
-
Добавляют антитела к искомому антигену (например, антитела к антигену герпеса или хламидиоза). Полученную смесь выдерживают от получаса до 5 часов для получения устойчивых иммунных комплексов. Причём чем больше оказалось антигенов во взятой пробе, тем больше образуется связок антиген-антитело.
-
Удаление (вымывание) избыточных антител — в результате в лунке остаются только связанные антитела.
-
Проведение ферментативной реакции — добавление фермента, специфичного к метке, с которой предварительно были соединены все антитела, в результате получают окрашенное соединение
-
Колориметрическое измерение интенсивности цвета, которая и соответствует концентрации оставшихся в лунке меток и, соответственно, антител.
Несмотря на простоту прямого метода, сегодня в лабораториях чаще используют непрямой анализ, значительно выигрывающий в чувствительности и точности. Этапы проведения:
-
Биологический материал фиксируют в лунке и затем связывают с немечеными антителами.
-
Вымывают избыточные (не связанные) антитела.
-
Полученные иммунные комплексы связывают повторно, но уже с мечеными антителами, в результате образуется триада антиген-немеченое антитело-меченое антитело.
-
Вымывают избыточные меченые антитела.
-
Проводят ферментативную реакцию для получения окрашенного соединения в результате взаимодействия метки (субстрата) с ферментом.
-
По концентрации меток определяют содержание антител и, соответственно, антигенов.
Преимущество непрямого метода — двойной контроль (исключены ошибки, поскольку антитела вводятся дважды, и дважды выполняют вымывание несвязанных антител), поэтому значительно повышается чувствительность и специфичность метода.
Кроме непревзойдённой точности, достоинство метода ИФА — его универсальность: иммуноферментная диагностика подходит для обнаружения гормонов и маркеров болезней щитовидной железы и сердца, онкомаркеров, диагностики аутоиммунных, инфекционных заболеваний и репродуктивной функции. Метод продолжает развиваться, расширяется список показаний, совершенствуется применяемое аналитическое оборудование и расходные материалы.